一、實驗準(zhǔn)備

1、健康的HEK 293T細(xì)胞，一般使用復(fù)蘇后10代以內(nèi)的細(xì)胞進行慢病毒的生產(chǎn)，要求無細(xì)菌、真菌以及支原體污染；

2、轉(zhuǎn)染試劑，如PEI、Higene、lipo2000或lipo3000

各種轉(zhuǎn)染試劑的步驟稍有差別，小助手以PEI為轉(zhuǎn)染試劑。

3、DMEM無血清無雙抗培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基（10%FBS和1%P/S）；

4、10mL無菌注射器(環(huán)氧乙烷滅菌處理)；

5、0.45μm的細(xì)菌濾器。

二、包裝步驟

Day1

（7:00 PM）鋪板HEK 293T細(xì)胞

數(shù)量：400萬/10 cm dish ；覺得計數(shù)麻煩的話，可以在293T細(xì)胞長到約90%匯合時，1:5傳代（均分成5份），每1份的數(shù)目差不多就是400萬了。

Day2

（3:00 PM）三質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

在培養(yǎng)箱中恢復(fù)細(xì)胞狀態(tài)約20h，此時可進行轉(zhuǎn)染。三質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染體系三種質(zhì)粒的配比有許多種方式，目前MDL使用4:3:1的比例，即PxpAx2：PMD2g：PLVX(載有你基因的質(zhì)粒)。10cm dish一般轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的總質(zhì)量為20μg，PEI的量為質(zhì)粒的2.5-3倍（也就是50μg-60μg，一般推薦按照2.5倍來）。按照比例算下來，PxpAx2：PMD2g：PLVX的質(zhì)量比為：(10ug:7.5ug:2.5ug)

注意：在提到質(zhì)粒的量時，千萬記得說質(zhì)量而不是濃度，不然容易出錯。

實驗步驟：

取如上總質(zhì)量為20μg的質(zhì)粒添加到總體積500μL的DMEM無血清無雙抗培養(yǎng)基中，記為A液，移液槍混勻20次；

取PEI(一般配置成1μg/mL)50-60μg（也就是50-60μL）添加到總體積500μL的DMEM無血清無雙抗培養(yǎng)基中，記為B液，移液槍混勻20次；

將B液逐滴滴加到A液中，移液槍輕柔混勻66次，室溫靜置15-20min；

將靜置好的轉(zhuǎn)染試劑（A+B）緩緩滴加到恢復(fù)狀態(tài)20h的HEK 293T細(xì)胞中。

做好標(biāo)記，記好轉(zhuǎn)染時間、轉(zhuǎn)染質(zhì)粒、換液時間等參數(shù)提高實驗重復(fù)性。

Day3

（9:00 AM）換液

轉(zhuǎn)染后的第18h，將含有轉(zhuǎn)染試劑的HEK 293T上清更換為10mL DMEM培養(yǎng)基；對于新手，為了防止在換液時將細(xì)胞吹散，可以留3mL的液體在dish中，更換8mL DMEM培養(yǎng)基。

Day4

（3:00 PM）收集病毒液

在轉(zhuǎn)染后的48-72h，為病毒生產(chǎn)的高峰期，一般我們收集轉(zhuǎn)染后48h（換液后30h，產(chǎn)毒30h）的病毒液用于實驗，足以滿足大部分實驗需求。收集病毒于15mL tube中，500g，5mL離心去細(xì)胞碎片和雜質(zhì)，隨后使用注射器和濾器進行過濾。收集后的病毒上清可以用來進行感染和儲存。

三、慢病毒滴度測定

病毒滴度的單位為：TU/mL，代表每毫升病毒液中具有轉(zhuǎn)導(dǎo)功能的病毒顆粒的數(shù)目。

計算公式為：滴度=（感染時細(xì)胞數(shù)（個）*陽性細(xì)胞%）/病毒液體積（mL）

病毒液體積和感染時細(xì)胞數(shù)已知，需通過流式細(xì)胞術(shù)確認(rèn)陽性細(xì)胞百分比。

滴度測定常常使用HEK 293T細(xì)胞，大致的原理為，將在DAY3收集到的病毒上清，按照梯度添加到293T細(xì)胞中，感染后48h檢測陽性細(xì)胞的比例，從而確定病毒的滴度。

四、注意事項

293T細(xì)胞的代數(shù)最好用15代以內(nèi)，最多不超過20代，否則影響轉(zhuǎn)染效率。質(zhì)粒濃度在400-1000ng/μL范圍，純度260/280在1.8-2.0之間的轉(zhuǎn)染效率較高?；旌象w輕輕滴入細(xì)胞上清后搖勻，動作要輕，293T細(xì)胞貼壁不牢避免細(xì)胞脫落。