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生化培養(yǎng)箱在多管發(fā)酵法的應(yīng)用

更新時間:2015-10-22點擊次數(shù):1862
     1.多管發(fā)酵法
    初發(fā)酵實驗 發(fā)酵管內(nèi)裝有單倍或三倍乳糖蛋白胨培養(yǎng)液,并在內(nèi)倒置有小玻璃管。每個樣品用三個不同的水樣量接種,同一接種水樣量要有五管,將水樣分別接種到裝有乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的發(fā)酵管中,在37℃±0.5℃下培養(yǎng)24h±2h。乳糖能起選擇作用,因為很多細(xì)菌不能發(fā)酵乳糖,而大腸菌群能發(fā)酵乳糖并產(chǎn)酸產(chǎn)氣???培養(yǎng)液中加入溴甲酚紫作為酸度指示劑,細(xì)菌產(chǎn)酸后,培養(yǎng)液即由原來的紫色變成黃色。產(chǎn)酸產(chǎn)氣的發(fā)酵管表明試驗陽性,如在倒管內(nèi)產(chǎn)氣不明顯,可輕拍發(fā)酵管,有小氣泡升起為陽性。
    復(fù)發(fā)酵實驗輕微振蕩初發(fā)酵試驗陽性結(jié)果的發(fā)酵管,用3mm接種環(huán)將培養(yǎng)物(2-3環(huán))轉(zhuǎn)接到EC培養(yǎng)液中,在44.5℃±0.5℃下培養(yǎng)24h±2h(提高培養(yǎng)溫度可造成不利于來自自然環(huán)境的大腸菌群的生長)。培養(yǎng)后立即觀察,發(fā)酵管產(chǎn)氣則證實為糞大腸菌群陽性。
    2.濾膜法
    濾膜是一種微孔性濾膜,孔徑0.45μm。將水樣注入已滅菌的放有濾膜的過濾器中,經(jīng)過抽濾,細(xì)菌即被截留在膜上,然后將濾膜貼于M-FC培養(yǎng)基上,在44.5℃±0.5℃下培養(yǎng)24 h±2h。糞大腸菌群菌落在M-FC培養(yǎng)基上呈藍(lán)色或藍(lán)綠色,其他非糞大腸菌群菌落成灰色、淡黃色或無色。正常情況下,由于溫度和玫瑰酸鹽試劑的選擇性作用,在M-FC培養(yǎng)基上很少見到非糞大腸菌菌落。
    二.兩種方法的注意事項
    1.培養(yǎng)溫度的要求 總大腸菌群中的細(xì)菌除生活在腸道中外,在自然環(huán)境中的水與土壤中也經(jīng)常存在,但此等在自然環(huán)境中生活的大腸菌群培養(yǎng)的zui合適溫度為25℃左右,如在37℃培養(yǎng)則仍可生長,但如將培養(yǎng)溫度再升高至44.5℃,則不再生長,而直接來自糞便的大腸菌群細(xì)菌,習(xí)慣于37℃左右生長,如將培養(yǎng)溫度升高至44.5℃仍可繼續(xù)生長。因此,可用提高培養(yǎng)溫度的方法將自然環(huán)境中的大腸菌群與糞便中的大腸菌群區(qū)分,兩種方法也都基于此理。將接種好的樣品或裝有濾膜的培養(yǎng)基放入生化培養(yǎng)箱時,箱內(nèi)溫度一定要達(dá)到所要求的溫度(44.5±0.5℃)時,方可放入。如用恒溫水浴箱時,其水面要高于接種物面,放濾膜的培養(yǎng)皿要沉到水浴箱底部。
    2.加氯水樣的處理 經(jīng)氯處理消毒過的水樣,水中含有一定量的余氯,使大腸菌群處于受損或受抑制狀態(tài),在采集水樣時應(yīng)提前在采樣瓶中加硫代硫酸鈉,硫代硫酸鈉可以脫氯,使受損的細(xì)菌得以復(fù)蘇與修復(fù),從而避免出現(xiàn)計數(shù)結(jié)果偏低甚至假陰性的現(xiàn)象。此外余氯對濾膜法培養(yǎng)的細(xì)菌其抑制作用尤為明顯,所以抽濾時應(yīng)對水樣進行大量無菌水稀釋,以減少余氯的殘留。
    3.樣品的保存采樣用的容器使用前應(yīng)蓋好瓶蓋,用牛皮紙將瓶蓋和瓶頸處包裹好,置干燥箱160℃-170℃干熱滅菌2h,或用高壓蒸汽滅菌器121℃滅菌15min。采樣后水樣的正確保存也很重要,如保存不當(dāng)可使樣品中的大腸菌群細(xì)菌死亡或在一定條件下再生長,這些都將影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。檢測室接到水樣后,應(yīng)立即檢測,如因故不能檢測時,應(yīng)立即將樣品置于冰箱內(nèi)(2℃-10℃)并于2小時內(nèi)檢測。
    4.培養(yǎng)物質(zhì)的制備與保存
    ⑴.多管發(fā)酵法所使用的培養(yǎng)液在分裝于各發(fā)酵管中后,應(yīng)將發(fā)酵管盡快放于高壓蒸汽滅菌器中,在115℃滅菌20min(注意:這個溫度也應(yīng)控制好,既達(dá)到滅菌的作用,還要防止培養(yǎng)物質(zhì)分解流失),然后貯存于冰箱或暗處備用。
    ⑵.濾膜法所采用的M-FC培養(yǎng)基多使用外購的成品,培養(yǎng)基中苯胺藍(lán)的純度和質(zhì)量往往影響菌落的顏色,因此,無菌包裝的成套培養(yǎng)基在使用前,先接種典型糞大腸菌,以觀察對比菌落的顏色,來鑒定其穩(wěn)定性。
    5.結(jié)果統(tǒng)計
    ⑴.多管發(fā)酵法的結(jié)果是根據(jù)不同接種量的發(fā)酵管所出現(xiàn)陽性結(jié)果的數(shù)目,從MPN表中查得相應(yīng)的MPN指數(shù),來計算每升水中糞大腸菌群細(xì)菌的MPN值。MPN是“Most Probable Number”的縮寫,指zui大可能數(shù),它是根據(jù)統(tǒng)計學(xué)理論,估計水體中的菌群密度和衛(wèi)生質(zhì)量的一種方法,所以準(zhǔn)確判斷不同接種量發(fā)酵管的陽性數(shù)是非常重要的,否則將導(dǎo)致較大偏差。
    ⑵.濾膜法的結(jié)果是計數(shù)濾膜上呈藍(lán)或藍(lán)綠色的菌落,來計算出每升水樣中的糞大腸菌群數(shù)。所以為便于計數(shù),減少誤差,理想的水樣體積是一片濾膜上生長20-60個糞大腸菌群菌落。
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